De protestantse Reformatie in de zestiende eeuw zorgde voor een splijting binnen het Christendom. De publicatie van de 95 stellingen door Maarten Luther wordt over het algemeen gezien als het begin van het protestantisme. Luther keerde zich met name tegen de verkoop van aflaten die zondaars van hun schulden zouden verlossen. Volgens Luther kon niet de kerk of de mens zelf zorgen voor de kwijtschelding van zijn schuld maar was dit voorbehouden aan God. Luther werd in 1521 door paus Leo X geëxcommuniceerd.

Naast Luther was de Fransman Johannes Calvijn een belangrijke persoon in de Reformatie. In 1533 schreef hij mee aan een rede voor de universiteit van Parijs waarin hij veelvuldig Erasmus en Luther aanhaalde. Calvijn werd gedwongen te vluchten uit Parijs en hij sloot zich aan bij andere reformatoren in Zwitserland. Hier publiceerde hij het boek Onderwijs in het christelijk geloof waarin hij zijn theologische opvattingen uiteen zette. Calvijn zou hiermee uitgroeien tot een van de meest invloedrijke hervormers in de kerk.

Een andere belangrijke groep binnen de Reformatie waren de anabaptisten of wederdopers. Zij vonden dat alleen volwassen mensen gedoopt mochten worden. Dit had ermee te maken dat de wederdopers de kerk zagen als een vereniging op basis van vrijwilligheid los van staatsbemoeienis. De ideeën van de wederdopers werden door veel lutheranen en calvinisten overigens sterk afgewezen.